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組織樣品中RNA的提取實驗：本實驗的組織樣品主要有小鼠的各個組織器官（如肝臟，肌肉，脂肪等）和人腫瘤標(biāo)本（如結(jié)直腸癌，肺癌，乳腺癌）

1.首先要根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的TRIZOL液體，同時加入若干顆不銹鋼柱。本實驗室一般情況如下：（小鼠組織加入TRIZOL,結(jié)直腸癌標(biāo)本加入TRIZOL）

注意：

a.用凈信勻漿機進行勻漿處理時樣品體積最好不要超過TRIzol體積10℅）

b.需事先預(yù)冷試管座

2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子，點擊運行

3.機器運行完畢后，打開蓋子，拿出凈信EP管仔細觀察組織的研磨情況，如果沒有明顯的塊狀物，那就可以進入下一步實驗步驟，如果沒有完全打碎，還需要把EP管放入試管座中，繼續(xù)勻漿。有些堅硬，或者脂肪含量高的組織（乳腺）可能需要稍微長一點的時間，時間可以依據(jù)組織實際的研磨情況來調(diào)整勻漿時間。

4.和傳統(tǒng)的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩若干秒，室溫放置幾分鐘。

6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。

7.把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇，室溫放置幾分鐘。

8.2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘，棄上清。

10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。

常見問題分析：

1得率低：

A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

B.RNA沉淀未完全溶解

C.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

D．樣品勻漿時加的試劑量太少

E．勻漿樣品時未在室溫放置幾分鐘

F．吸取水相時混入了有機相

2 RNA降解

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C.細胞在用胰酶處理時過度

D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理

E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

3 DNA污染:

A.樣品勻漿時加的試劑量太少

B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液

預(yù)防RNase污染注意事項：

1．經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，霉菌可能成為RNase的來源。

2．使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

3．RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4．配制溶液應(yīng)使用無RNase的水

本實驗已經(jīng)研磨的各個組織中發(fā)現(xiàn)肝臟組織是最容易研磨，研磨效率是最好的。

下圖A是RNA經(jīng)過傳統(tǒng)的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖，結(jié)果很明顯發(fā)現(xiàn)這種方法是可行的，是可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法的。

下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個組織進行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發(fā)現(xiàn)在抽提各個組織的RNA的時候也是可行的。

圖C是利用組織勻漿器對人結(jié)腸癌標(biāo)本進行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。

圖D是小鼠的肝臟組織經(jīng)過手工研磨和機器勻漿后，最后抽提得到的RNA進行了濃度的測定，結(jié)果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統(tǒng)的手工的方法得到的RNA。

蛋白質(zhì)的提取

A.根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的蛋白質(zhì)裂解液（如RIPA），同時加入3顆不銹鋼柱。（小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液，人結(jié)直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液）

B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子，點擊運行。

以下同上RNA的操作方法

最終所得到的蛋白質(zhì)濃度的測定經(jīng)過BCA試劑盒測定完成的，同時通過SDS-PAGE后經(jīng)過考馬斯亮藍染色和western blot檢測都發(fā)現(xiàn)其要比傳統(tǒng)的方法更加簡便快捷，不容易引起交叉污染。

更多實驗細節(jié)可致電工作人員！